试验试剂
BTS稀释液、PI、H42、CM-H2DCFDA
常规指标
活性、密度、活率、运动参数、顶体完整性、质膜完整性
精子 氧化及抗氧化
MDA丙二醛、ROS、TOS总氧化状态、T-AOC总抗氧化能力、SOD超氧化物歧化酶、CAT过氧化氢酶、GSH-Px谷胱甘肽过氧化物酶
线粒体
JC-1线粒体膜电位、MTROS线粒体超氧化物
其他
凋亡水平、超微结构、ATP水平、LDH乳酸脱氢酶、DNA碎片化水平
2025/3 第一次试验 观察药物效果
祥欣铜川公猪站 任站长13488006000
2025/3/3发货，快递时效1 d，预计收货时为采集后第1 d。
组别及检测指标见下表，于保存第1/3/5/7 d各检测一次，最后测定活力低于0.6的时间。每组设置3个重复。
| BLPs浓度组别 | 密度 | 活率 | 活力 | 运动参数 | 质膜完整性 | 顶体完整性 | 最长保存时间 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 mg/L | |||||||
| 10 mg/L | |||||||
| 20 mg/L | |||||||
| 40 mg/L | |||||||
| 60 mg/L | |||||||
| 80 mg/L |
1.精液保存
BTS 精液稀释液：37.15 g葡萄糖，6.0 g柠檬酸钠，1.25 g碳酸氢钠，1.25 g乙 二胺四乙酸钠，0.75 g氯化钾，pH值调节到7.2，定容至1 L，滤菌膜过滤，4℃冰箱保存，最好现配现用。如需添加抗生素，青霉素0.6 g、链霉素1 g。
（2400 g，3 min，17℃离心后以稀释液重悬）
5 mL离心管分装，每份1.5 mL。加入BLPs。组化间17℃温箱，毛巾包裹保存。
保存期间每12 h上下翻动一次
2.CASA检测
准备工作：载玻片盖玻片（走廊冰箱）、浮漂（温箱下面抽屉）、枪和枪头（柜子下层有空盒子，现装）、离心管、管架
预热水浴锅及加热板
样品倾斜摇匀后，离心管中部取100 μL加入1.5 mL离心管，浮漂固定，37℃水浴5 min
预热载玻片、盖玻片
取5/8/10 μL精液，一个载玻片可加两份样。盖玻片后静置约1 min，检测各项指标，截屏保存（活力不对可重新加热再测）
3.质膜完整性检测
低渗液提前置于4℃冰箱复温
2 mL离心管中加入1 mL低渗液，37℃水浴预热5 min
加入0.1 mL样品，上下混匀，37℃水浴孵育30-60 min
CASA检测
如低渗液效果不明显，可改用清水并缩短处理时间
4.顶体完整性检测
配置FITC-PNA染液：染料使用前先37℃复温10 min，之后离心吸取上清（降低非特异性背景染色）。推荐浓度5-20 μg/mL。文献中最大浓度200 μg/mL
取30 μL精液于粘附载玻片上，盖玻片推匀，自然风干
无水甲醇固定10 min，自然风干
滴加30 μL FITC-PNA染液，37℃避光孵育30 min，PBS洗
滴加30 μL DAPI染液，室温避光孵育10 min，PBS洗
封片，观察拍照
25/3/4 精液稀释及分装
12:00 调整温箱温度
15:00 取到样品，30 mL未稀释原精，17℃温箱保存
取10 μL滴于玻片组化间显微镜镜检，低倍镜下见密集精子，高倍镜模糊，赶时间未继续观察
配置稀释液：37.15 g葡萄糖，6.0 g柠檬酸钠，1.25 g碳酸氢钠，1.25 g乙 二胺四乙酸钠，0.75 g氯化钾，0.6 g青霉素钠，1.0 g硫酸链霉素，双蒸水充分溶解，定容至1 L
取0.1 g BLPs，以10 mL稀释液溶解，配置为10 g/L=10 μg/μL BLPs
取5 mL精液x2，置于两个50 mL离心管中；取约100 mL稀释液于烧杯中
37℃水浴加热10 min，保证精液和稀释液温差小于1℃
将稀释液缓慢加入精液中，先1：1稀释，颠倒混匀，然后再加入稀释液至两管稀释比例分别为1：4和1：9
取1：9的稀释精液，每8 mL分装1管总计6管，实验组加入8/16/32/48/64 μL BLPs，上下颠倒混匀
全部样品置于17℃温箱，稀释液及BLPs置于4℃冰箱保存
